Protein S Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401491-ACT

PROS1 codifica la Proteina S umana, una glicoproteina plasmatica vitamina K–dipendente che funge da cofattore essenziale della proteina C attivata, promuovendo l’inattivazione proteolitica dei fattori della coagulazione Va e VIIIa e limitando così la generazione di trombina. La Proteina S interagisce anche con l’inibitore della via del fattore tissutale e si lega alle superfici fosfolipidiche in modo calcio-dipendente, collegando la biologia delle membrane al controllo anticoagulante. Attraverso queste attività, PROS1 partecipa all’emostasi, all’omeostasi vascolare e al crosstalk infiammatorio; alterazioni della sua espressione o funzione sono associate a fenotipi di coagulazione disregolata e a una maggiore suscettibilità trombotica. Al di là della coagulazione, la segnalazione della Proteina S tramite le vie recettoriali TAM è stata implicata nell’efferocitosi e nella modulazione immunitaria, a conferma della sua rilevanza in ambiti di ricerca vascolare e infiammatoria.

Protein S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PROS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Protein S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PROS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PROS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Protein S. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PROS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Protein S nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Protein S nelle cellule tumorali con espressione di PROS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.