PRAT4A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404775-ACT

CNPY3 codifica PRAT4A, uno chaperone localizzato nel reticolo endoplasmatico che supporta la maturazione e il traffico dei recettori Toll-like, incluso TLR4, facilitandone il corretto ripiegamento e assemblaggio durante la biosintesi. Regolando la disponibilità dei recettori sulla superficie cellulare, PRAT4A contribuisce a plasmare il riconoscimento innato e la segnalazione a valle attraverso programmi trascrizionali dipendenti da NF-κB e IRF. Un’alterazione della funzione di PRAT4A può perturbare le risposte di citochine infiammatorie e le interazioni ospite–microbo, rendendo CNPY3 rilevante per studi sulla disregolazione immunitaria e sui meccanismi di malattia associati all’infiammazione. Nei sistemi cellulari umani, PRAT4A viene spesso studiata nel contesto del controllo di qualità del RE, della biogenesi dei recettori e della dinamica di segnalazione dei recettori di riconoscimento dei pattern.

PRAT4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CNPY3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PRAT4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CNPY3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CNPY3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PRAT4A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CNPY3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PRAT4A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PRAT4A nelle cellule tumorali con espressione di CNPY3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.