POL H CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401794-ACT

POLH kodiert die DNA-Polymerase Eta (Pol η), eine spezialisierte Polymerase der Y-Familie, die während der S‑Phase eine Translesions-DNA-Synthese durchführt, um UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere und andere sperrige DNA-Addukte zu umgehen. Durch die Verlängerung ins Stocken geratener Replikationsgabeln trägt POLH zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität bei und koordiniert sich mit der DNA-Schadensantwort, der Nukleotid-Exzisionsreparatur und den postreplikativen Reparaturwegen. Defekte in POLH beeinträchtigen die Genauigkeit des Lesions-Bypasses und erhöhen die Mutationslast, was seine Fehlfunktion mit UV-Empfindlichkeit und Krebsprädispositions-Phänotypen in Verbindung bringt, darunter die Xeroderma-pigmentosum-Variante. POLH ist daher ein широко untersuchtes Gen in der Biologie des Replikationsstresses, bei Mutagenese-Mechanismen und beim Crosstalk von Signalwegen, der die Wahl des DNA-Reparaturwegs steuert.

POL H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POL H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POL H-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POL H-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POL H-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.