Pit-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401671-ACT

O POU1F1 humano codifica o fator de transcrição Pit-1, específico da hipófise, com domínio POU-homeobox, um regulador central da especificação de linhagens da hipófise anterior e da expressão de genes endócrinos. O Pit-1 liga-se a elementos conservados de promotores e potenciadores (enhancers) para controlar programas transcricionais necessários ao desenvolvimento de somatotrófos, lactotrófos e tireotrófos, coordenando-se com co-reguladores e complexos de remodelação da cromatina para definir a identidade celular. Este eixo integra a sinalização do desenvolvimento hipofisário e as vias de síntese hormonal ao modular genes-alvo chave, incluindo GH1, PRL e TSHB. A desregulação ou variantes patogénicas em POU1F1 estão associadas a défices de hormonas hipofisárias e ao hipopituitarismo congénito, tornando o Pit-1 um modelo amplamente utilizado para estudar a diferenciação endócrina e o controlo de redes transcricionais.

Pit-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POU1F1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Pit-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POU1F1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POU1F1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Pit-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POU1F1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Pit-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Pit-1 em células tumorais com expressão de POU1F1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.