PHF5A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407986-ACT

PHF5A (proteína de dedo PHD 5A) é um componente conservado do subcomplexo SF3b do snRNP U2 e dá suporte à montagem do espliceossomo e à fidelidade do splicing do pré‑mRNA. Ao estabilizar o reconhecimento do ponto de ramificação e do sítio de splicing 3′, o PHF5A contribui para a seleção de isoformas de transcritos que impacta a progressão do ciclo celular, as respostas a dano no DNA e programas de diferenciação. A perturbação do splicing dependente de PHF5A pode remodelar redes de expressão gênica e tem sido associada a vulnerabilidades em contextos de processamento de RNA desregulado, incluindo estados oncogênicos em que a função do espliceossomo está sob estresse. Como fator central de splicing, o PHF5A é frequentemente utilizado para investigar vias de maturação de RNA e mecanismos impulsionados por splicing subjacentes a mudanças fenotípicas.

PHF5A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PHF5A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PHF5A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PHF5A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PHF5A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PHF5A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PHF5A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PHF5A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PHF5A em células tumorais com expressão de PHF5A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.