PBGD Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420870-ACT

O gene Hmbs de camundongo codifica a porfobilinogênio desaminase (PBGD), uma enzima citosólica que catalisa a polimerização de quatro moléculas de porfobilinogênio para formar hidroximetilbilano, um intermediário central na via de biossíntese do heme. Ao sustentar a disponibilidade de heme, a PBGD influencia a respiração mitocondrial, a função dos citocromos e a homeostase redox, com efeitos a jusante sobre a maturação eritroide e o metabolismo oxidativo celular. A perturbação da atividade de HMBS/PBGD está associada a desordens do metabolismo das porfirinas e ao acúmulo de intermediários a montante, tornando esse gene um nó-chave para modelar respostas ao estresse metabólico. Assim, Hmbs é relevante para estudos de fisiologia hepática e hematopoética, bioenergética mitocondrial e regulação, em nível de via, da síntese de tetrapirróis.

PBGD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hmbs sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PBGD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hmbs em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hmbs, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PBGD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hmbs nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PBGD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PBGD em células tumorais com expressão de Hmbs silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.