paxillin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422546-ACT

Il gene murino Pxn codifica la paxillina, un adattatore delle adesioni focali che coordina la segnalazione mediata dalle integrine con il rimodellamento del citoscheletro di actina per regolare l’adesione cellulare, l’espansione (spreading) e la migrazione direzionale. La paxillina funge da scaffold per chinasi e regolatori delle GTPasi nei siti di adesione, collegando i segnali della matrice extracellulare a vie come FAK/Src, PI3K-AKT e la segnalazione della famiglia Rho, che controllano le forze di trazione e la meccano-trasduzione. Attraverso queste reti, la paxillina influenza proliferazione, sopravvivenza e dinamiche epitelio-mesenchimali, risultando rilevante per studi sul comportamento cellulare invasivo e sul rimodellamento tissutale. La deregolazione della segnalazione della paxillina e del turnover delle adesioni focali è comunemente studiata in modelli di progressione tumorale, riparazione delle ferite e microambienti infiammatori.

paxillin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pxn senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

paxillin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pxn nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pxn, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di paxillin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pxn nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da paxillin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via paxillin nelle cellule tumorali con espressione di Pxn silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.