OST48 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403323-ACT

DDOST codifica OST48, una subunità fondamentale del complesso oligosaccariltransferasi (OST) nel reticolo endoplasmatico rugoso, che catalizza la glicosilazione N-linked co-traduzionale delle proteine nascenti secretorie e di membrana. Sostenendo la maturazione e il controllo di qualità delle glicoproteine, OST48 collega la biogenesi proteica alla proteostasi del RE, alla segnalazione della risposta alle proteine non correttamente ripiegate (unfolded protein response, UPR) e alle vie di degradazione associate al RE (ER-associated degradation, ERAD). Alterazioni della N-glicosilazione possono perturbare il traffico dei recettori, la comunicazione cellula-cellula e il riconoscimento immunitario, e la deregolazione di DDOST è stata studiata in contesti in cui il rimodellamento del glicoproteoma e lo stress del RE sono caratteristiche prominenti. In quanto componente “housekeeping” della macchina OST, DDOST è spesso utilizzato per indagare come la capacità di glicosilazione influenzi la segnalazione delle vie e la fitness cellulare.

OST48 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DDOST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OST48 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DDOST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DDOST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OST48. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DDOST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OST48 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OST48 nelle cellule tumorali con espressione di DDOST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.