OST48 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403323-ACT

DDOST kodiert OST48, eine zentrale Untereinheit des Oligosaccharyltransferase-(OST)-Komplexes im rauen endoplasmatischen Retikulum, der die kotranslationale N‑verknüpfte Glykosylierung neu entstehender sekretorischer und membranständiger Proteine katalysiert. Indem OST48 die Reifung von Glykoproteinen sowie Qualitätskontrolle unterstützt, verknüpft es die Proteinbiosynthese mit der ER‑Proteostase, der Signalgebung der Unfolded‑Protein‑Response (UPR) und den ER‑assoziierten Abbauwegen (ERAD). Veränderte N‑Glykosylierung kann den Rezeptortransport, die Zell‑Zell‑Kommunikation und die Immunerkennung stören, und eine Dysregulation von DDOST wurde in Kontexten untersucht, in denen eine Umgestaltung des Glykoproteoms und ER‑Stress ausgeprägte Merkmale sind. Als Housekeeping‑Komponente der OST‑Maschinerie wird DDOST häufig genutzt, um zu untersuchen, wie die Glykosylierungskapazität die Signalweiterleitung in Signalwegen und die zelluläre Fitness beeinflusst.

OST48 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DDOST-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

OST48 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DDOST-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DDOST-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen OST48-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DDOST-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von OST48-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des OST48-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DDOST-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.