OST48 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403323-ACT

DDOST codifica a OST48, uma subunidade central do complexo oligosacariltransferase (OST) no retículo endoplasmático rugoso, que catalisa a glicosilação N-ligada co-traducional de proteínas secretoras e de membrana recém-sintetizadas. Ao sustentar a maturação e o controle de qualidade de glicoproteínas, a OST48 conecta a biogênese proteica à proteostase do RE, à sinalização da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e às vias de degradação associada ao RE (ERAD). Alterações na N-glicosilação podem perturbar o tráfego de receptores, a comunicação célula–célula e o reconhecimento imune, e a desregulação de DDOST tem sido investigada em contextos nos quais a remodelação do glicoproteoma e o estresse do RE são características marcantes. Como componente constitutivo (“housekeeping”) da maquinaria OST, o DDOST é frequentemente usado para avaliar como a capacidade de glicosilação influencia a sinalização de vias e a aptidão celular.

OST48 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDOST sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OST48 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDOST em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDOST, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OST48. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDOST nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OST48 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OST48 em células tumorais com expressão de DDOST silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.