ORMDL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403586-ACT

ORMDL1 (orosomucoide-símile 1) é uma proteína de membrana residente do retículo endoplasmático que atua como um regulador conservado da homeostase dos esfingolipídios por meio da inibição da serina palmitoiltransferase, a enzima limitante de taxa na síntese de novo de ceramida. Ao ajustar os reservatórios (pools) de ceramida e esfingomielina, a ORMDL1 influencia a composição de membranas, as respostas ao estresse do RE e processos de sinalização a jusante ligados ao crescimento celular e a vias inflamatórias. A desregulação do metabolismo de esfingolipídios e o estresse do RE têm sido implicados em fenótipos cardiometabólicos e relacionados ao sistema imune, tornando a ORMDL1 um nó relevante para estudos mecanísticos de sinalização dirigida por lipídios. Em biologia do câncer e em contextos de adaptação ao estresse, alterações na expressão de ORMDL1 têm sido associadas a mudanças em programas de proliferação, migração e sobrevivência de maneira dependente do tipo celular.

ORMDL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ORMDL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ORMDL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ORMDL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ORMDL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ORMDL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ORMDL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ORMDL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ORMDL1 em células tumorais com expressão de ORMDL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.