OCT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402232-ACT

SLC22A1 codifica per il trasportatore di cationi organici 1 (OCT1), un trasportatore di soluti a specificità ampia che media l’assorbimento, indipendente dal sodio, di ammine endogene e di diversi cationi organici xenobiotici attraverso la membrana plasmatica. L’attività di OCT1 determina la distribuzione cellulare di metaboliti e farmaci carichi, influenzando la gestione epatica dei composti circolanti e contribuendo alla variabilità interindividuale della farmacocinetica dipendente dal trasporto. Controllando la disponibilità intracellulare dei substrati cationici, OCT1 si integra con vie di detossificazione e di omeostasi metabolica, inclusi processi che modulano lo stress ossidativo e la funzione mitocondriale. Un’alterata espressione di SLC22A1 o variazioni genetiche sono state associate a differenze nella risposta ai farmaci e sono state investigate nei disturbi epatici e nella biologia dei tumori come determinanti dell’assorbimento mediato da trasportatori.

OCT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC22A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OCT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC22A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC22A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OCT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC22A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OCT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OCT1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC22A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.