Nup133 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433405-ACT

Maus-Nup133 kodiert eine zentrale strukturelle Komponente des Nup107–160-Subkomplexes des Kernporenkomplexes (NPC), der den Aufbau von Kernporen ermöglicht und den nukleozytoplasmatischen Transport unterstützt. Indem Nup133 zur Organisation der NPC-Architektur beiträgt, beeinflusst es den Transport von RNA und Proteinen, den Zellzyklusfortschritt und die Dynamik der Kernhülle, einschließlich ihrer Wiederassemblierung nach der Mitose. Störungen in der Zusammensetzung des NPC können globale Genexpressionsprogramme verändern, weil der Transport von Transkriptionsfaktoren und der RNA-Prozessierungsmaschinerie beeinträchtigt wird. Als zentrales Nukleoporin wird Nup133 häufig in Zusammenhängen untersucht, die nuklearen Transport und die Integrität der Kernhülle mit Entwicklungsphänotypen und zellulären Stressantworten verknüpfen.

Nup133 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Nup133-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nup133 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Nup133-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Nup133-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nup133-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Nup133-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nup133-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nup133-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Nup133-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.