NPR-B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401861-ACT

NPR2 codifica o receptor B do peptídeo natriurético (NPR-B), uma guanilil ciclase de membrana que se liga ao peptídeo natriurético tipo C para gerar cGMP e ativar a sinalização a jusante dependente de PKG. Essa via regula a ossificação endocondral, a proliferação e a diferenciação de condrócitos e, de forma mais ampla, o controle de programas de crescimento celular por meio da modulação do transporte de íons e de respostas transcricionais mediadas por cGMP. A sinalização de NPR2 se interliga a redes de desenvolvimento esquelético e à homeostase da placa de crescimento, e perturbações genéticas ou funcionais estão associadas a distúrbios do crescimento longitudinal e da biologia da cartilagem. Além dos fenótipos do desenvolvimento, alterações na sinalização peptídeo natriurético–cGMP são relevantes para estudos de regulação do tônus vascular e de remodelamento tecidual em modelos celulares humanos.

NPR-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NPR-B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NPR-B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NPR-B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NPR-B em células tumorais com expressão de NPR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.