NMDAζ1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400593-ACT

GRIN1 codifica a subunidade do recetor NMDA NMDAζ1 (também conhecida como GluN1), um componente essencial dos recetores ionotrópicos de glutamato heterotetraméricos que medeiam a neurotransmissão excitatória permeável a Ca²⁺ no sistema nervoso central humano. Os recetores que contêm NMDAζ1 integram a atividade sináptica com vias de sinalização a jusante que regulam a plasticidade sináptica, o desenvolvimento neuronal e a expressão génica dependente da atividade, incluindo processos associados a CaMK/CREB e MAPK. A função de GRIN1 está estreitamente ligada ao equilíbrio excitação/inibição, à potenciação de longa duração e à maturação de redes neurais, tornando-o um nó central em vias que governam a aprendizagem e a memória. A sinalização desregulada do recetor NMDA e variações em GRIN1 têm sido associadas a fenótipos do neurodesenvolvimento e neuropsiquiátricos, motivando estudos mecanísticos sobre a composição do recetor e o controlo transcricional.

NMDAζ1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GRIN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NMDAζ1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GRIN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GRIN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NMDAζ1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GRIN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NMDAζ1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NMDAζ1 em células tumorais com expressão de GRIN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.