NHE-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404353-ACT

SLC9A2 codifica o trocador Na+/H+ NHE-2, um antiporte da membrana plasmática que regula o pH intracelular, o volume celular e a absorção de sódio ao acoplar o influxo de Na+ ao efluxo de H+. A atividade do NHE-2 sustenta o transporte epitelial de íons e fluidos e contribui para a manutenção da função de barreira da mucosa, ligando-o a vias que governam o movimento transepitelial de eletrólitos e a homeostase ácido–base. Por meio do controle dependente de pH da atividade enzimática, da dinâmica do citoesqueleto e da integridade das junções, o NHE-2 influencia a proliferação e as respostas ao estresse em células polarizadas. A desregulação da troca Na+/H+ tem sido associada a alterações do transporte gastrointestinal e renal e a fenótipos relacionados à inflamação, tornando o SLC9A2 um alvo relevante para estudos mecanísticos da fisiologia epitelial e da remodelação do transporte associada a doenças.

NHE-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHE-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHE-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHE-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHE-2 em células tumorais com expressão de SLC9A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.