NHE-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400748-ACT

SLC9A1 codifica o trocador humano Na+/H+ 1 (NHE-1), um antiporte da membrana plasmática que extrude H+ intracelular em troca de Na+ extracelular para manter o pH citosólico, regular o volume celular e sustentar a homeostase iônica. A atividade do NHE-1 interage com a sinalização por fatores de crescimento e com o remodelamento do citoesqueleto para influenciar proliferação, migração e adaptação ao estresse, além de contribuir para o controle, dependente de pH, do metabolismo e da atividade enzimática. A desregulação da função do NHE-1 e da homeostase de pH tem sido associada a programas alterados de sobrevivência e motilidade celular na biologia do câncer, bem como a mecanismos de lesão relacionados à isquemia em pesquisas cardiovasculares e neurológicas. Como o NHE-1 acopla o transporte iônico a saídas de sinalização, SLC9A1 é frequentemente estudado em vias envolvendo MAPK/ERK, GTPases Rho e respostas celulares à hipóxia e ao estresse oxidativo.

NHE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC9A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NHE-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC9A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC9A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NHE-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC9A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NHE-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NHE-1 em células tumorais com expressão de SLC9A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.