NFS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403102-ACT

O NFS1 humano codifica uma dessulfurase de cisteína que mobiliza enxofre a partir da L-cisteína para sustentar a biogênese de clusters ferro–enxofre (Fe–S) nas mitocôndrias, atuando em conjunto com proteínas parceiras na maquinaria central de montagem. Ao possibilitar a maturação de enzimas dependentes de Fe–S, o NFS1 influencia a fosforilação oxidativa, o metabolismo mitocondrial dependente de ácido lipoico e a homeostase redox, com efeitos a jusante na replicação/reparo do DNA e nas respostas celulares ao estresse. A perturbação da montagem de clusters Fe–S pode comprometer a função da cadeia respiratória e a atividade de enzimas metabólicas, conectando vias reguladas por NFS1 à disfunção mitocondrial e a fenótipos de estabilidade genômica estudados em diversos contextos relevantes para doenças. Como um nó central na biossíntese de cofatores mitocondriais, o NFS1 é frequentemente investigado em modelos de vulnerabilidade metabólica, estresse oxidativo e estados proliferativos alterados.

NFS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NFS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NFS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NFS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NFS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NFS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NFS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NFS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NFS1 em células tumorais com expressão de NFS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.