NELF-E Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401932-ACT

O gene humano **NELFE** codifica a **NELF-E**, uma subunidade de ligação a RNA do complexo **fator de elongação negativa (NELF)**, que impõe a pausa promotor-proximal da RNA polimerase II e molda a elongação inicial da transcrição. Por meio da coordenação com **DSIF** e **P-TEFb**, a NELF-E ajuda a regular o timing transcricional, programas gênicos responsivos a estímulos e o processamento de RNA co-transcricional, incluindo o acoplamento a eventos da extremidade 5′. Esse controle é central para vias que governam a progressão do ciclo celular, a diferenciação e respostas ao estresse, nas quais dinâmicas alteradas de elongação podem remodelar redes de expressão gênica. A desregulação da pausa transcricional e do controle de elongação, incluindo componentes do complexo NELF, tem sido associada a programas aberrantes de crescimento e de linhagem observados em diversos contextos relevantes para doenças, tornando **NELFE** um nó útil para estudos mecanísticos da regulação da transcrição.

NELF-E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NELFE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NELF-E O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NELFE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NELFE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NELF-E. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NELFE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NELF-E no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NELF-E em células tumorais com expressão de NELFE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.