NCKX6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406101-ACT

SLC8B1 kodiert NCKX6, einen kaliumabhängigen Natrium/Calcium-Austauscher, der zur intrazellulären Ca²⁺-Homöostase beiträgt, indem er Na⁺- und K⁺-Gradienten an den Ca²⁺-Efflux über Zellmembranen koppelt. Durch die Formung der zytosolischen Calciumdynamik kann NCKX6 calciumsensitive Signalnetzwerke beeinflussen, die Erregbarkeit, Sekretion und nachgeschaltete transkriptionelle Antworten regulieren. Eine veränderte Ca²⁺-Handhabung wird breit mit zellulären Stressantworten und fehlregulierter Signalübertragung in zahlreichen krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, wodurch SLC8B1 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zu ionentransportgekoppelten Signalwegen darstellt. Die Untersuchung der NCKX6-Funktion unterstützt die Forschung dazu, wie Membrantransportprozesse mit calciumabhängigen Signalwegen und Phänotypen in menschlichen Zellen zusammenwirken.

NCKX6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC8B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NCKX6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC8B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC8B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NCKX6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC8B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NCKX6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NCKX6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC8B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.