Myosin Va Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402108-ACT

MYO5A codifica a proteína motora baseada em actina miosina Va, uma miosina processiva que acopla a hidrólise de ATP ao transporte de longa distância de organelos ligados à membrana e complexos proteicos ao longo de filamentos de actina. Em células humanas, a miosina Va dá suporte ao tráfego de vesículas, ao encaminhamento endocítico/exocítico e à entrega polarizada de cargas, contribuindo para a organização do citoesqueleto e para o controlo espacial da sinalização na periferia celular. O transporte dependente de MYO5A cruza-se com vias reguladas por GTPases Rab e com a fusão de membranas mediada por SNARE para posicionar grânulos secretórios, recetores e complexos de mRNA/proteína. A disrupção ou desregulação de MYO5A tem sido associada a defeitos no transporte intracelular que podem afetar a função neuronal e a biologia relacionada com pigmentação, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de fenótipos de doença ligados ao tráfego.

Myosin Va O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MYO5A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Myosin Va O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MYO5A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MYO5A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Myosin Va. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MYO5A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Myosin Va no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Myosin Va em células tumorais com expressão de MYO5A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.