Myosin Id Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403425-ACT

O MYO1D humano codifica a miosina Id, um motor associado à membrana e dependente de actina, implicado no acoplamento do citoesqueleto cortical de actina às membranas intracelulares. A miosina Id sustenta processos como o tráfego de membranas, a reciclagem endocítica e a organização da polaridade e da forma celular, ligando a remodelação do citoesqueleto ao controlo espacial da sinalização na membrana plasmática. Através destas funções, o MYO1D pode influenciar vias que dependem do transporte vesicular direcionado e da distribuição de recetores dependente do citoesqueleto. A desregulação da dinâmica actina–membrana e dos programas de polaridade é relevante para fenótipos associados a doença, incluindo migração celular alterada e organização epitelial comprometida, tornando o MYO1D um alvo útil para estudos mecanísticos em homeostase celular.

Myosin Id O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MYO1D sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Myosin Id O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MYO1D em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MYO1D, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Myosin Id. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MYO1D nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Myosin Id no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Myosin Id em células tumorais com expressão de MYO1D silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.