mtTFA Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423355-ACT

Tfam codifica o fator de transcrição mitocondrial A (mtTFA), uma proteína do grupo de alta mobilidade (HMG) que se liga ao DNA mitocondrial para empacotar os nucleoides e regular a transcrição e a replicação do genoma mitocondrial. O mtTFA é um determinante central do número de cópias de mtDNA e da expressão gênica mitocondrial, influenciando assim a fosforilação oxidativa, a produção de ATP e a homeostase de espécies reativas de oxigênio. Por meio dessas funções, ele se integra a programas de biogênese mitocondrial e a vias de comunicação núcleo–mitocôndria que moldam o metabolismo celular e as respostas ao estresse. Alterações na atividade de TFAM e na manutenção do mtDNA são frequentemente investigadas em modelos de disfunção neuromuscular, neurodegeneração, fenótipos cardiometabólicos e inflamação impulsionada por sinalização de estresse mitocondrial.

mtTFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tfam sem alterar a sequência de ADN subjacente.

mtTFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tfam em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tfam, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de mtTFA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tfam nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de mtTFA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via mtTFA em células tumorais com expressão de Tfam silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.