MREG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405725-ACT

MREG umano (melanoregulin) codifica una piccola proteina associata alla membrana, implicata nella biogenesi dei melanosomi e nel trasporto dei granuli di pigmento, influenzando la maturazione e la distribuzione degli organelli correlati ai lisosomi. MREG partecipa a processi di traffico intracellulare che si intersecano con le dinamiche endosomiale–lisosomiale e con il trasporto mediato dal citoscheletro, contribuendo al posizionamento degli organelli e alla gestione del carico. Attraverso i suoi ruoli nella biologia della pigmentazione e nell’omeostasi degli organelli, un’alterata attività di MREG è rilevante per studi sui fenotipi pigmentari e su difetti più ampi delle vie di trasporto vescicolare. Queste funzioni rendono MREG un nodo utile per analizzare i meccanismi di maturazione degli organelli, lo smistamento del carico e le risposte cellulari alle perturbazioni del traffico.

MREG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MREG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MREG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MREG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MREG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MREG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MREG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MREG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MREG nelle cellule tumorali con espressione di MREG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.