MLKL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401248-ACT

A MLKL humana (proteína semelhante a domínio de quinase de linhagem mista) é um efetor central da necroptose, atuando a jusante da sinalização de RIPK1/RIPK3 para desencadear morte celular inflamatória e lítica. Após a fosforilação por RIPK3, a MLKL sofre ativação conformacional, oligomeriza-se e transloca-se para membranas celulares, onde compromete a integridade da membrana e promove a liberação de padrões moleculares associados a dano (DAMPs). Essa via se cruza com respostas imunes inatas, sinalização por citocinas e a comunicação entre vias de morte celular regulada com apoptose e piroptose, moldando a inflamação tecidual e a defesa do hospedeiro. A atividade desregulada de MLKL e a sinalização necroptótica têm sido implicadas em modelos de processos inflamatórios e neurodegenerativos, lesão isquêmica e biologia do microambiente tumoral, tornando a MLKL um ponto útil para estudos mecanísticos.

MLKL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MLKL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MLKL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MLKL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MLKL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MLKL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MLKL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MLKL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MLKL em células tumorais com expressão de MLKL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.