MCAD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402708-ACT

ACADM codifica la deidrogenasi acil-CoA a catena media umana (MCAD), una flavoproteina mitocondriale che catalizza il primo passaggio di deidrogenazione nella β-ossidazione degli acil-CoA degli acidi grassi a catena media. L’attività della MCAD sostiene l’omeostasi energetica cellulare consentendo un catabolismo efficiente degli acidi grassi durante il digiuno e lo stress metabolico, collegando l’equilibrio redox mitocondriale alla produzione di ATP. L’alterazione o la ridotta espressione di ACADM è associata a un’ossidazione compromessa degli acidi grassi a catena media e a caratteristici profili di accumulo di acilcarnitine, ampiamente utilizzati nella ricerca metabolica. Di conseguenza, ACADM/MCAD è spesso studiato in relazione a vie che regolano la funzione mitocondriale, l’utilizzo dei lipidi e programmi trascrizionali sensibili ai nutrienti.

MCAD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACADM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCAD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACADM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACADM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCAD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACADM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCAD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCAD nelle cellule tumorali con espressione di ACADM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.