MARK4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404386-ACT

MARK4 (quinase 4 reguladora da afinidade por microtúbulos) é uma quinase de serina/treonina da família MARK relacionada à AMPK que modula a estabilidade dos microtúbulos ao fosforilar proteínas associadas a microtúbulos, como TAU/MAPT. Por meio da regulação da dinâmica do citoesqueleto, MARK4 contribui para a polaridade celular, o transporte intracelular e processos mitóticos, e interage com redes de sinalização que coordenam sinais de estresse e metabólicos com a remodelação de microtúbulos. A atividade desregulada de MARK4 tem sido associada a alterações na organização dos microtúbulos neuronais e vem sendo investigada em contextos de neurodegeneração, bem como em fenótipos associados ao câncer, incluindo mudanças na proliferação e na migração. Essas características tornam a MARK4 um alvo útil para estudos mecanísticos de vias dependentes de microtúbulos e da organização celular regulada por quinases.

MARK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MARK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MARK4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MARK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MARK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MARK4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MARK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MARK4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MARK4 em células tumorais com expressão de MARK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.