Limd1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424343-ACT

Mouse LIM domain containing 1 (Limd1) codifica uma proteína adaptadora com domínio LIM que se localiza em complexos de adesão e do citoesqueleto e contribui para a organização das adesões focais e para a dinâmica da actina. A LIMD1 participa da integração de sinais em contatos célula–matriz e tem sido associada à regulação do output da via Hippo por meio da modulação da atividade de YAP/TAZ, influenciando assim a proliferação, a inibição por contato e a mecanotransdução. Ela também se conecta a redes de controle transcricional e a sinalização responsiva ao estresse, que moldam a progressão do ciclo celular e a diferenciação. Alterações na expressão ou na função de LIMD1 estão associadas a um controle de crescimento desregulado e a fenótipos invasivos em múltiplos modelos relevantes para doenças, tornando o Limd1 um nó útil para o estudo de vias semelhantes às de supressores tumorais e de sinalização dependente de adesão.

Limd1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Limd1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Limd1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Limd1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Limd1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Limd1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Limd1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Limd1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Limd1 em células tumorais com expressão de Limd1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.