KCNMB4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405044-ACT

KCNMB4 codifica la subunità ausiliaria β4 dei canali del potassio a grande conduttanza (BK), attivati da calcio e voltaggio, modulandone la cinetica di gating, la sensibilità al calcio e l’eccitabilità di membrana. Nei neuroni umani e in altri tessuti eccitabili, KCNMB4 contribuisce a regolare la frequenza di scarica dei potenziali d’azione e la ripolarizzazione calcio-dipendente, integrandosi con la segnalazione del Ca2+ e con l’omeostasi elettrofisiologica. Modellando il comportamento dei canali BK, influenza processi quali la neurotrasmissione, l’adattamento della frequenza di spike e vie di segnalazione dipendenti dall’attività legate alla regolazione dei canali ionici. Una composizione deregolata dei canali BK, inclusa un’alterata espressione delle subunità β, è implicata in fenotipi neurologici in cui è compromesso l’equilibrio dell’eccitabilità, a supporto della sua utilità in studi meccanicistici delle canalopatie e dello stress cellulare guidato dall’eccitabilità.

KCNMB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNMB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCNMB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNMB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNMB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCNMB4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNMB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCNMB4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCNMB4 nelle cellule tumorali con espressione di KCNMB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.