KCC3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405975-ACT

SLC12A6 codifica il cotrasportatore potassio–cloruro KCC3, un membro della famiglia dei cotrasportatori catione-cloruro che media un efflusso elettroneutro di K+ e Cl− per regolare il cloruro intracellulare, l’equilibrio osmotico e il volume cellulare. L’attività di KCC3 contribuisce al mantenimento del potenziale di membrana e dell’eccitabilità neuronale plasmando i gradienti di cloruro che influenzano la neurotrasmissione inibitoria, ed è modulata da vie di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione, sensibili allo stress cellulare e all’omeostasi ionica. Nel sistema nervoso, KCC3 sostiene l’integrità degli assoni e della mielina e partecipa alle risposte al rigonfiamento cellulare e alle perturbazioni ioniche. L’alterazione genetica o la disregolazione di SLC12A6 è associata a fenotipi neurosviluppativi e neurodegenerativi, inclusi neuropatia periferica e anomalie della sostanza bianca, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi di trasporto ionico in tipi cellulari pertinenti alla patologia.

KCC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC12A6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC12A6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC12A6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCC3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC12A6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCC3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCC3 nelle cellule tumorali con espressione di SLC12A6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.