INF2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410096-ACT

A INF2 humana (formin invertida 2) codifica um fator de nucleação de actina que acopla a sinalização de GTPases da família Rho à remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina e a eventos associados de tráfego de membranas. A INF2 participa de processos como a organização de fibras de estresse, a regulação de contatos entre o retículo endoplasmático e as mitocôndrias e a fissão mitocondrial por meio de polimerização coordenada de actina. Alterações na atividade da INF2 têm sido associadas à desregulação da homeostase do citoesqueleto e da polaridade celular, e estão relacionadas a fenótipos relevantes para doenças em podócitos renais e neurônios periféricos. Como um nó de via que integra a dinâmica da actina à função de organelas, a INF2 é rotineiramente estudada em modelos de distúrbios do citoesqueleto e de remodelação da rede mitocondrial.

INF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de INF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

INF2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus INF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição INF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de INF2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus INF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de INF2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via INF2 em células tumorais com expressão de INF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.