HSP 75 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402640-ACT

TRAP1 (HSP 75) ist ein mitochondriales Chaperon der HSP90-Familie, das die Proteinfaltung und Qualitätskontrolle in der mitochondrialen Matrix reguliert und damit die Integrität der Atmungskette sowie die zelluläre Stresstoleranz unterstützt. Durch die Modulation der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore, der Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies und des bioenergetischen Flusses verknüpft TRAP1 die Chaperon-Aktivität mit metabolischer Anpassung und Proteostase-Signalwegen. Eine TRAP1-abhängige Umprogrammierung der mitochondrialen Funktion wurde in verschiedenen zellulären Kontexten mit veränderter Apoptose-Empfindlichkeit, oxidativen Stressantworten und Verschiebungen zwischen oxidativer Phosphorylierung und Glykolyse in Verbindung gebracht. Eine dysregulierte TRAP1-Expression oder -Aktivität wurde mit Tumorbiologie, Neurodegeneration und anderen Erkrankungen assoziiert, bei denen mitochondriale Dysfunktion und proteotoxischer Stress zur Pathologie beitragen.

HSP 75 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRAP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSP 75 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRAP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRAP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSP 75-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRAP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSP 75-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSP 75-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRAP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.