HSF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400432-ACT

Il fattore di shock termico 1 (HSF1) è un regolatore trascrizionale maestro della risposta cellulare allo shock termico, che mantiene la proteostasi in condizioni di stress inducendo proteine da shock termico e co-chaperoni, incluse le reti HSP70 e HSP90. Nelle cellule umane, HSF1 integra i segnali di stress proteotossico con programmi di controllo trascrizionale e traduzionale, plasmando le risposte allo stress ossidativo, al ripiegamento errato delle proteine e alle sfide ambientali. L’attività di HSF1 interseca vie che governano il controllo di qualità proteico, l’autofagia e le decisioni di sopravvivenza cellulare, e un’alterata regolazione dei programmi di stress legati a HSF1 è stata associata alla biologia del cancro e ai meccanismi delle malattie neurodegenerative. La modulazione dell’espressione di HSF1 è quindi utile per analizzare i circuiti di adattamento allo stress e il rimodellamento del trascrittoma a valle in diversi modelli cellulari.

HSF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSF1 nelle cellule tumorali con espressione di HSF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.