HPA1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402215-ACT

HPSE umano codifica l’eparanasi (HPA1), un’endo-β-D-glucuronidasi che scinde le catene di eparan solfato sui proteoglicani, rimodellando la matrice extracellulare e le membrane basali. Liberando fattori di crescita e citochine legati all’eparan solfato, HPA1 modula le interazioni cellula–matrice, i gradienti chemiotattici, la segnalazione angiogenica e il traffico delle cellule infiammatorie, intersecando vie che controllano adesione, migrazione e permeabilità tissutale. L’attività di HPSE è associata a dinamiche alterate del microambiente tumorale, alla biologia di invasione e metastasi e a un’infiammazione deregolata in molteplici contesti patologici. Di conseguenza, HPSE è ampiamente utilizzato come nodo meccanicistico per studiare il turnover della matrice extracellulare, il reclutamento di cellule immunitarie e la segnalazione mediata dai proteoglicani.

HPA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HPSE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HPA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HPSE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HPSE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HPA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HPSE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HPA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HPA1 nelle cellule tumorali con espressione di HPSE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.