HMGCR CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420877-ACT

Das murine Hmgcr kodiert die 3‑Hydroxy‑3‑methylglutaryl‑CoA‑Reduktase (HMGCR), das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des Mevalonatwegs, das HMG‑CoA zu Mevalonat umsetzt und die zelluläre Cholesterin‑ und Isoprenoidbiosynthese steuert. Durch die Regulierung der Sterolverfügbarkeit beeinflusst HMGCR die Membranzusammensetzung, den Lipoproteinstoffwechsel sowie die rückgekoppelte Kontrolle der Lipidhomöostase über SREBP‑abhängige Transkriptionsprogramme und den ER‑assoziierten Abbau. Der Stofffluss durch den Mevalonatweg unterstützt zudem die Proteinprenylierung und wirkt sich damit auf die Signalübertragung kleiner GTPasen, den vesikulären Transport und die Regulation des Zellwachstums aus. Veränderte HMGCR‑Aktivität und die Ausbeute des Mevalonatwegs werden häufig als experimentelle Ansatzpunkte genutzt, um Mechanismen im Zusammenhang mit Dyslipidämien, metabolischer Inflammation und der lipidabhängigen Modulation von Zellproliferation und Differenzierung zu untersuchen.

HMGCR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Hmgcr-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HMGCR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Hmgcr-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Hmgcr-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HMGCR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Hmgcr-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HMGCR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HMGCR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Hmgcr-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.