HMGCR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400560-ACT

O HMGCR codifica a 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA redutase, uma enzima de membrana do retículo endoplasmático (RE) que catalisa a conversão limitante da velocidade de HMG-CoA em mevalonato na via de biossíntese do colesterol. Ao controlar o fluxo de mevalonato, o HMGCR influencia a produção downstream de esteróis e isoprenoides, que sustenta a biogénese de membranas, a prenilação de proteínas e uma homeostase metabólica mais ampla. A sua atividade é rigorosamente regulada pela transcrição dependente de SREBP, pelo feedback de deteção de esteróis e pela degradação associada ao RE, ligando o estado nutricional à síntese de lípidos. A expressão desregulada de HMGCR ou a atividade da via é frequentemente estudada em hipercolesterolemia, mecanismos relacionados com a aterosclerose, síndrome metabólica e estados proliferativos em que a dependência da via do mevalonato pode moldar fenótipos celulares.

HMGCR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HMGCR sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HMGCR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HMGCR em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HMGCR, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HMGCR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HMGCR nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HMGCR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HMGCR em células tumorais com expressão de HMGCR silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.