HMGCL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403841-ACT

L’HMGCL umano codifica la liasi del 3-idrossimetil-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), un enzima mitocondriale che catalizza l’ultima tappa della chetogenesi e contribuisce al catabolismo della leucina generando acetoacetato e acetil-CoA. Questa attività favorisce l’adattamento cellulare al digiuno e allo stress metabolico collegando il flusso di acetil-CoA derivato dagli acidi grassi alla produzione di corpi chetonici e alla successiva omeostasi energetica. La funzione di HMGCL si integra con il metabolismo mitocondriale del carbonio e con l’equilibrio redox, influenzando la disponibilità di acetil-CoA per processi biosintetici e di segnalazione. Alterazioni dell’attività di HMGCL sono associate a errori congeniti del metabolismo che compromettono la produzione di corpi chetonici e possono essere studiate in contesti in cui la riprogrammazione metabolica mitocondriale e l’utilizzo dei nutrienti influenzano i fenotipi cellulari.

HMGCL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HMGCL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HMGCL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HMGCL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HMGCL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HMGCL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HMGCL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HMGCL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HMGCL nelle cellule tumorali con espressione di HMGCL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.