HIF1a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400036-ACT

HIF1A kodiert den hypoxieinduzierbaren Faktor 1 alpha (HIF1a), einen sauerstoffsensitiven Transkriptionsfaktor, der die zelluläre Anpassung an niedrigen Sauerstoffpartialdruck koordiniert. Nach Stabilisierung dimerisiert HIF1a mit ARNT (HIF‑1β) und bindet an Hypoxie-Response-Elemente, um Gene zu regulieren, die Glykolyse, angiogene Signalgebung, Erythropoese, pH‑Homöostase und Zellüberleben steuern. Dieses Sauerstoff-Sensorprogramm ist mit der PI3K–AKT–mTOR-Signalgebung, dem mitochondrialen Stoffwechsel und Redoxwegen verknüpft und prägt dadurch Entzündungs- und Immunzellzustände ebenso wie stromales Remodeling. Eine Fehlregulation der HIF1A-Aktivität wird mit Reaktionen auf ischämische Schäden, chronischer Entzündung und der Biologie des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht und macht HIF1A zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien hypoxiegetriebener Phänotypen.

HIF1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HIF1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HIF1a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HIF1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HIF1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HIF1a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HIF1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HIF1a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HIF1a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HIF1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.