HEATR5B CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-412293-ACT-2

Das humane Gen HEATR5B kodiert ein HEAT-Repeat-haltiges Protein, dem eine Funktion als Gerüstfaktor (Scaffold) zugeschrieben wird, der Multiprotein-Komplexe organisiert und intrazellulären Transport sowie zytoskelettgekoppelte Prozesse unterstützt. Auf Grundlage der bekannten Rollen von HEAT-Repeat-Proteinen wird erwartet, dass HEATR5B den nukleozytoplasmatischen Transport, die Dynamik von Proteinkomplexen und die stressabhängige Regulation der Genexpression beeinflusst, mit nachgelagerten Effekten auf Zellwachstum und Differenzierungswege. Eine veränderte Aktivität oder Expression von HEATR5B kann zu pathogenen Mechanismen beitragen, die mit gestörter Transporthomöostase und aberranter Signalübertragung einhergehen, was das Gen für Studien komplexer zellulärer Dysfunktionen bei menschlichen Erkrankungen relevant macht. Die Geneditierung von HEATR5B ist nützlich, um Knockout- oder markierte Zellmodelle zu erzeugen, Interaktome zu kartieren, die subzelluläre Lokalisation zu bestimmen und phänotypische Effekte auf Signalweg-Ebene mithilfe transkriptomischer und proteomischer Ausleseverfahren zu untersuchen.

HEATR5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HEATR5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HEATR5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HEATR5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HEATR5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HEATR5B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HEATR5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HEATR5B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HEATR5B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HEATR5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.