h-prune Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412914-ACT

PRUNE1 codifica a h-prune, uma fosfoesterase da família DHH implicada no metabolismo de nucleotídeos cíclicos e na regulação da motilidade celular. A h-prune interage com nós de sinalização que influenciam a remodelação do citoesqueleto, a dinâmica de turnover das adesões focais e processos ligados à proliferação e à migração, incluindo crosstalk com PI3K/AKT e vias relacionadas. A alteração da atividade de PRUNE1 tem sido associada a fenótipos de desenvolvimento e neurobiológicos desregulados, e é frequentemente investigada no contexto de programas celulares associados à invasão em oncologia. Como resultado, PRUNE1 constitui um alvo útil para dissecar mecanismos de migração, sinalização metabólica e estados transcricionais que moldam comportamentos celulares relevantes para a doença.

h-prune O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PRUNE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

h-prune O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PRUNE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PRUNE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de h-prune. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PRUNE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de h-prune no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via h-prune em células tumorais com expressão de PRUNE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.