G_{α 14} Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404556-ACT

GNA14 codifica a subunidade alfa Gα14 da proteína G heterotrimérica humana, um membro da família Gq/11 que acopla GPCRs ativados à sinalização da fosfolipase C-β. Após o engajamento do receptor, a Gα14 promove a hidrólise de PIP2 para gerar IP3 e DAG, desencadeando a mobilização de Ca2+ intracelular, a ativação da proteína quinase C e programas transcricionais a jusante associados à secreção, à contração do músculo liso e à sinalização de células imunes. Esse eixo interage com as vias de MAPK e de GTPases Rho, que coordenam proliferação, remodelamento do citoesqueleto e migração celular. A desregulação da sinalização GPCR–Gq envolvendo GNA14 tem sido associada a estados de sinalização alterados em contextos proliferativos e inflamatórios, sustentando seu estudo em modelos celulares relevantes para doenças.

Gα 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNA14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα 14 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNA14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNA14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα 14. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNA14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα 14 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα 14 em células tumorais com expressão de GNA14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.