G_{α 13} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401180-ACT

GNA13 codifica la subunità alfa Gα13 della proteina G eterotrimerica umana, un trasduttore chiave dei segnali provenienti da molteplici GPCR verso le vie delle GTPasi della famiglia Rho. Una volta attivata, Gα13 coinvolge RhoGEF quali ARHGEF12 (LARG), promuovendo il rimodellamento del citoscheletro guidato da RhoA, la contrattilità cellulare e la regolazione dell’adesione e della migrazione cellulare. Questo asse di segnalazione contribuisce alla funzione vascolare e delle cellule immunitarie e si interfaccia con la meccanotrasduzione e con programmi di espressione genica che plasmano la plasticità cellulare. Una segnalazione di GNA13 deregolata è stata associata a fenotipi alterati di invasione e sopravvivenza in modelli di cancro, e perturbazioni ricorrenti di GNA13 sono state riportate in alcune neoplasie ematologiche, a supporto della sua rilevanza per ricerche focalizzate sulle vie di segnalazione.

Gα 13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNA13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα 13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNA13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNA13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα 13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNA13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα 13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα 13 nelle cellule tumorali con espressione di GNA13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.