Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α 11}: sc-401653-ACT

GNA11 code pour la sous-unité alpha Gα11 de la protéine G hétérotrimérique humaine, un transducteur majeur des signaux issus des GPCR couplés à Gq/11 vers des voies effectrices en aval. Après activation du récepteur, Gα11 stimule la phospholipase C-β, favorisant la production d’IP3/DAG, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et l’activation de la protéine kinase C, avec des effets en aval sur MAPK/ERK et sur des programmes transcriptionnels contrôlant la prolifération, la sécrétion et la différenciation. La signalisation de GNA11 contribue à la régulation du tonus vasculaire, des fonctions endocrines et de l’excitabilité neuronale, et la dérégulation de cet axe a été associée à des signalisations oncogéniques et à une altération du contrôle de l’état cellulaire dans divers contextes pathologiques. En tant que nœud proximal de la transduction du signal des GPCR, Gα11 est fréquemment étudiée pour disséquer le biais de signalisation des voies, les réponses dépendantes du calcium et les interactions (cross-talk) avec la signalisation des facteurs de croissance.

Gα 11 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNA11 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα 11 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNA11 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNA11, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα 11. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNA11 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα 11 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα 11 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNA11 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.