GS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405996-ACT

A PUDP humana (pseudouridina 5′-fosfatase), também conhecida como GS1, é uma enzima citosólica da rede de salvamento de pirimidinas que desfosforila a pseudouridina 5′-monofosfato em pseudouridina, apoiando a renovação e a reciclagem de nucleosídeos modificados derivados do catabolismo de RNA. Ao regular os níveis de nucleotídeos de pseudouridina, a PUDP influencia a homeostase de nucleotídeos e se conecta a vias que governam a dinâmica de modificações de RNA, o metabolismo de ribonucleotídeos e respostas celulares ao estresse metabólico. A forma como nucleosídeos modificados são processados tem sido cada vez mais associada à desregulação da renovação de RNA e à reprogramação metabólica observadas em diversos contextos de doença, tornando a PUDP um ponto útil para estudos mecanísticos. A modulação da expressão de PUDP/GS1 permite investigar como o metabolismo de pseudouridina impacta programas de expressão gênica e a fisiologia celular.

GS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PUDP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PUDP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PUDP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PUDP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GS1 em células tumorais com expressão de PUDP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.