GnT-I CRISPR Activationプラスミド (h): sc-409648-ACT

MGAT1は、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI（GnT-I）をコードしており、これはメディアル・ゴルジに局在する酵素で、高マンノース型N-グリカンを複合型およびハイブリッド型N-グリカンへ変換する過程における、最初の実質的（不可逆的）なステップを触媒します。GnT-IはN結合型糖鎖修飾における分岐形成を開始することで、分泌系および膜タンパク質にわたって、タンパク質のフォールディング、安定性、受容体のトラフィッキング、ならびに細胞–細胞間および細胞–細胞外マトリックス間相互作用に影響を与えます。MGAT1依存的な糖鎖リモデリングはゴルジ体でのプロセシング経路と統合され、接着や増殖因子応答性に関与する糖タンパク質からのシグナル出力を調節します。MGAT1活性の破綻やN-グリカン構造の変化は、がん生物学、免疫制御、ならびに先天性糖鎖合成異常症（CDG）の文脈で、異常な細胞表現型に至る機序的要因として頻繁に検討されています。

GnT-I CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性MGAT1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GnT-I CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における MGAT1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はMGAT1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GnT-Iの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のMGAT1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGnT-I依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびMGAT1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGnT-I経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。