GnRH I Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420625-ACT

O gene Gnrh1 do camundongo codifica o hormônio liberador de gonadotrofinas I (GnRH I), um neuropeptídeo hipotalâmico que coordena a função endócrina reprodutiva ao estimular as células gonadotróficas da hipófise a secretarem o hormônio luteinizante e o hormônio folículo-estimulante. A sinalização pulsátil de GnRH I aciona vias dependentes do receptor de GnRH acopladas a Gq/11, promovendo a ativação de PLCβ, a mobilização de Ca2+ intracelular, cascatas de PKC/MAPK e programas transcricionais que regulam a síntese e a liberação de gonadotrofinas. Por meio da integração com a kisspeptina, o feedback de esteroides sexuais e entradas circadianas/metabólicas, Gnrh1 contribui para o timing da puberdade, a fertilidade e a fisiologia reprodutiva cíclica. A desregulação da produção ou da sinalização de GnRH I é relevante em modelos experimentais de hipogonadismo hipogonadotrófico, distúrbios puberais e alterações neuroendócrinas que afetam a homeostase do eixo reprodutivo.

GnRH I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gnrh1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GnRH I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gnrh1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gnrh1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GnRH I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gnrh1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GnRH I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GnRH I em células tumorais com expressão de Gnrh1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.