GLUD1 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402187-ACT

ヒトのGLUD1は、ミトコンドリア型グルタミン酸脱水素酵素1をコードしている。この酵素はNAD(P)+依存性で、グルタミン酸をα-ケトグルタル酸とアンモニアへ可逆的に酸化的脱アミノ化する反応を触媒し、アミノ酸分解代謝とTCA回路を結び付ける。グルタミン酸の利用とアナプレロティック（補充）フラックスのバランスを調節することで、GLUD1は細胞のバイオエネルゲティクス、レドックス恒常性、窒素代謝に影響を及ぼし、その下流で神経伝達物質プールや代謝カップリングにも作用する。GLUD1活性はミトコンドリア機能および代謝シグナル伝達を制御する経路と連関しており、その制御異常はアミノ酸処理や神経内分泌性の代謝調節異常を伴う疾患と関連付けられている。これらの特徴により、GLUD1はミトコンドリア代謝およびグルタミン酸依存的な細胞表現型の機構解明研究における重要な標的となる。

GLUD1 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GLUD1の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

GLUD1 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GLUD1 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGLUD1転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性GLUD1の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGLUD1遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるGLUD1依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGLUD1発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるGLUD1経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。