GlcAT-S CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408633-ACT

B3GAT2 kodiert die Glucuronyltransferase S (GlcAT-S), eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glycosyltransferase, die bei der Biosynthese der für den Aufbau von Proteoglykanen erforderlichen Glykosaminoglykan-Protein-Verknüpfungsregion Glucuronsäure überträgt. Über ihre Rolle in der Glykosylierung und der Organisation der extrazellulären Matrix beeinflusst GlcAT-S Zell–Matrix-Interaktionen, Rezeptor-Signalgebung sowie Entwicklungsprozesse, die von korrekt modifizierten Proteoglykanen abhängen. Störungen der Proteoglykan-Biosynthese und der Bildung dieser Verknüpfungsregion werden mit veränderter Gewebearchitektur und Signalgebungsanomalien in Verbindung gebracht, die für die Bindegewebs- und neurobiologische Forschung relevant sind. Als humane Glykoenzym ist GlcAT-S zudem interessant, um zu untersuchen, wie Golgi-Glykosylierungsmuster die Zusammensetzung der Zelloberfläche und die Aktivität nachgeschalteter Signalwege prägen.

GlcAT-S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen B3GAT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GlcAT-S Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des B3GAT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der B3GAT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GlcAT-S-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native B3GAT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GlcAT-S-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GlcAT-S-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem B3GAT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.