GHR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401382-ACT

Il GHR umano codifica il recettore dell’ormone della crescita, un recettore citochinico transmembrana a singolo passaggio che lega l’GH per avviare la dimerizzazione del recettore e l’attivazione della segnalazione dipendente da JAK2. Le cascate a valle includono la trascrizione mediata da STAT5, nonché le vie PI3K–AKT e MAPK/ERK, che coordinano programmi di crescita, metabolismo e sopravvivenza cellulare in molteplici tessuti. L’attività di GHR influenza la regolazione dell’asse IGF e circuiti più ampi di feedback endocrino, rendendolo un nodo chiave negli studi sul controllo della crescita somatica e dell’omeostasi metabolica. Una segnalazione di GHR deregolata è associata a fenotipi di crescita ed endocrini ed è frequentemente analizzata in contesti che collegano la segnalazione GH–IGF a proliferazione, differenziamento e caratteristiche metaboliche sistemiche.

GHR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GHR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GHR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GHR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GHR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GHR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GHR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GHR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GHR nelle cellule tumorali con espressione di GHR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.