GCS-β-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403225-ACT

GUCY1B3 codifica la subunità beta 1 della guanilato ciclasi solubile (sGC-β1), un recettore chiave per l’ossido nitrico che catalizza la conversione del GTP in cGMP. Attraverso la produzione di cGMP, sGC-β1 contribuisce alla via di segnalazione NO–sGC–cGMP che regola il tono vascolare, la funzione piastrinica e il rilassamento della muscolatura liscia tramite effettori a valle quali PKG e le vie mediate da canali regolati da nucleotidi ciclici. Alterazioni della segnalazione sGC sono state associate a disfunzioni cardiovascolari e del circolo polmonare, difetti della segnalazione endoteliale e processi infiammatori. Nei modelli cellulari, l’attività di GUCY1B3 viene comunemente studiata monitorando la dinamica del cGMP, la responsività all’NO e i programmi trascrizionali associati a stress ossidativo o nitrosativo.

GCS-β-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GUCY1B3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCS-β-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GUCY1B3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GUCY1B3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCS-β-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GUCY1B3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCS-β-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCS-β-1 nelle cellule tumorali con espressione di GUCY1B3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.