GCS-α-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404305-ACT

GUCY1A2 kodiert die α2‑Untereinheit der löslichen Guanylatcyclase (sGC), eines heterodimeren Stickstoffmonoxid-(NO-)Rezeptors, der die Umwandlung von GTP zu cGMP katalysiert. Über cGMP‑abhängige Signalwege trägt sGC‑α2 zur Regulation des Tonus der vaskulären glatten Muskulatur, der Thrombozytenfunktion und der neuronalen Signalübertragung bei, indem sie die NO‑Produktion mit der nachgeschalteten PKG‑Aktivität und dem durch Phosphodiesterasen gesteuerten cGMP‑Umsatz verknüpft. Eine veränderte NO–sGC–cGMP‑Signalgebung ist an der kardiovaskulären und metabolischen Physiologie beteiligt und wird häufig in Zusammenhängen wie Endotheldysfunktion, eingeschränkter Vasoreaktivität und fehlregulierten Entzündungsreaktionen untersucht. Die Expression von GUCY1A2 und das Stöchiometrieverhältnis zu β‑Untereinheiten können die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber NO und oxidativem Stress modulieren, was es zu einem hilfreichen Knotenpunkt für die Analyse der Dynamik des cGMP‑Signalwegs macht.

GCS-α-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GUCY1A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCS-α-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GUCY1A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GUCY1A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCS-α-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GUCY1A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCS-α-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCS-α-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GUCY1A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.