Plásmido CRISPR de Activación (h) GCN1L1: sc-411545-ACT

El GCN1 humano (GCN1L1) codifica un cofactor asociado al ribosoma que acopla el estrés traduccional con la respuesta integrada al estrés al facilitar la activación de la quinasa de eIF2α GCN2 durante la limitación de aminoácidos y otros tipos de estrés nutricional relacionados. A través de esta función, GCN1L1 ayuda a coordinar la atenuación global de la traducción con programas de traducción selectiva que respaldan la proteostasis y la adaptación metabólica. La perturbación de la señalización de estrés regulada por GCN1L1 puede influir en las salidas transcripcionales dependientes de ATF4, la autofagia y las decisiones de supervivencia celular en condiciones de estrés proteotóxico o de privación de nutrientes. La desregulación de estas vías se ha implicado en contextos como la tolerancia al estrés de células tumorales, los defectos de proteostasis asociados a neurodegeneración y los mecanismos de enfermedades metabólicas, lo que convierte a GCN1L1 en un nodo útil para estudios centrados en vías.

GCN1L1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GCN1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GCN1L1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GCN1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GCN1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GCN1L1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GCN1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GCN1L1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GCN1L1 en células tumorales con expresión de GCN1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.